クリニカルシークエンシングについて某先生の講演を聞いた

某所でとある先生のクリニカルシークエンシングに関する講演を聞いた。そのときのメモを備忘録として置いておきます。聴きながらメモをとったものを書き起こしたので間違いがいっぱいあるかもしれません。

 

 

日本と海外のクリニカルシークエンシングの現状

アメリカのオバマ前大統領は一般教書演説においてプレシジョンメディシンの重要性を訴えた。プレシジョンメディシンとは、平均的な患者に向けた従来の治療デザインではなく、個人ごとの違いを考慮した、より正確な個別化医療を提供する考えである。アメリカではメガデータを基に研究コホートが作られ、研究基盤が構築された。欧米では医師の指示を受けて行われる遺伝学的検査として4600項目以上が実施可能であり、後方的解析としてこれらのデータを利用している学会もある。アメリカではMSK-IMPACTという検査セットがFDAに承認されており、既に1万以上のデータを出し、現在約2万症例の実績がある。

これに対して、日本のプレシジョンメディシンは出遅れているといってよい。現状では遺伝学的検査としては100項目程度しか実施できない。また、日本ではいくつかの大学がMSK-IMPACTを導入するに留まっている。厚生労働省は、この現状を打破するため「ゲノム情報を用いた医療などの実用化推進タスクフォース」を設立し、来年度の保険収載を目指す大胆な政策を提示した。近年SCRUM-JAPANという、患者の自己負担なしで希少肺がんと消化器癌を対象にした遺伝子検査に製薬企業が参入し、臨床試験に誘導する試みが行われている。他にもがんゲノム医療中核拠点を設定し、その下に連携病院を置き、がんゲノム医療の提供については集約化を図るようだ。

しかしながら実際に現場にクリニカルシークエンシングを導入するのはハードルが高い。アメリカでは、遺伝子検査の品質基準を保つのに臨床検査改善法基準の認証をもって運営能力を評価しているのに対して、本邦では基準の設定や法整備が遅れている。また、この認証取得は研究ラボでは費用が掛かりすぎて非現実的となっている。

 

クリニカルシークエンシングとは何か、何がわかるのか

クリニカルシークエンシングではまず、エクソン、プロモーター、重要なフュージョンなどの測るべき部位をあらかじめ決め、それに相補的な配列をもつライブラリーRNA「Baits」を設計する。BaitsはターゲットとするDNAに相補的な配列を持つことでターゲット領域とハイブリダイズする。この「Baits」はビオチン化されており、ストレプトアビジン磁気ビーズによって捉えられ、キャプチャされた配列だけを濃縮することが可能である。全ゲノム解析では3000Mb解析しなければならないが、全エクソン解析では60Mb、ターゲット解析では2Mbの解析でよい。当然ではあるがBaitの配列に含まれていない遺伝子の変異は検出できないので、留意すべきである。また、ターゲット部位がExonのみが含まれているのか転写調節領域が含まれているのかも意識するべきである。

MSK-IMPACT検査では検体に既知の460個もの遺伝子変異を検索する。一見、研究的側面は低いように思えるが、民族間での変異の頻度の違いなどを調べることができる。エクソンのみならず、Tertに関しては変異部位として重要なプロモーター領域まで読むことできる。さらに、BRAF遺伝子とのfusionの検出の際は、融合タンパクが未知であっても一続きのゲノムフラグメントは読むことができるので、新規のFusion Partnerが分かる

 

Clinical Sequencing時代の医師の仕事

実際の臨床現場では、生ファイルを「Pipeline」というプログラムに流すだけで変異を検出することができる。変異の検出アルゴリズムは、読まれた配列をヒトのリファレンスゲノムと照合し、変異をコンピューターに探索させるという流れである。本物の変異をなるべく落とさず、さらに検出された変異が真に変異である確率が高いシステムが望ましいので、変異の探索の後FilteringとCurationという処理が必要になる。Filtering処理とは、腫瘍に特異的で、かつ通常の検体で珍しい変異をFisher検定で導くので、陽性的中率が高くなる。また、同一患者のノーマルコントロールがある場合リファレンスとの間のFisher検定を行うことでcall errorを考慮し、真の変異を抽出しやすくなる。ノーマルコントロールがない場合は「Pipeline」が自動的にリファレンスと照合する。

また、次世代シークエンスがエラーしやすい領域をコンピューター上でFisher統計処理することによって、その部位が真に変異に相当するかが判断される。変異の割合は腫瘍コンテンツにおいて異なることや、シークエンス深度が配列の部位によってばらつくことなどもコンピューターのFilteringによって加味される。

また、検出された変異であってもSNPs、Germline、特定の民族で多い変異などは患者にとっては無意味な情報である。このためCuration処理によってそうした変異を検出しない操作を行う。エラー除去、さらに患者さんによっては伝えてはならない変異を「忖度」する必要がある。また、偽陽性を見過ごさないために、繰り返し配列などシークエンスエラーが起こりやすい領域( Noisy Loci )があるということを意識する必要がある。また、フォワードとリバースの一方でしか検出されない箇所はエラーだとみなす必要がある。さらに、他の健常者の検体で多く見つかるようなものはその場所はSequence errorが生じやすいと判断する。偽陰性を防ぐためには、大規模調査によって登録された変異「hotspot」に生じたerror callは緩めに設定する必要がある。現在、血液腫瘍を中心に経験的に、偽陰性の多い領域のhotspotのデータベースが作成されている。

京都大学病院では既に電子カルテ上にこうしたデータの管理とレポート作成が表示されるようになっているようだ。東大医科研では人工知能Watson for Genomicsが導入されており、pubmedなどの論文データからターゲットとなる薬剤、そのパスウェイ、進行している臨床試験なども示されるようになっている。今後、医師にはゲノムリテラシーが必要になり、こうした次世代シークエンサーの原理を理解すると同時に限界も認識する必要がある。

考察

このセミナーの後、私は実際に次世代シークエンサーで分かってきた臨床的知見について調べてみた。腫瘍だけでなく潰瘍性大腸炎クローン病などの炎症性腸疾患 (IBD) も近年、次々に候補遺伝子が挙げられてきている (Uhelig and Muise, Trends in Genetics, 2017)。 IBD発症のひとつとして顕著なのが免疫機構の破綻であり、IL10Rの変異が候補遺伝子と分かってからというもの、幼児期発症の患者に対して造血幹細胞移植が有効であることが明らかになった。自然免疫系の破綻ではメバロン酸キナーゼの欠損やNLRC4の欠損が知られるようになり、IL18あるいはIL1R阻害剤などが検討されている。HSCTが無効な患者では上皮組織の破綻が指摘されており、現在、間葉系幹細胞移植などが腸内免疫を整える重要な治療になりうるのではないかと考えられている。

次世代シークエンス登場以前の遺伝学的検査は、幼児期発症などの特徴的な発症様式や長期に及ぶ治療抵抗性のみの解析に終始していた。また、従来の検査では、診断がなされるのに時間を要し、標的治療が実際に行われるころには既に組織のダメージが不可逆的に進行し手遅れになっていた。次世代シークエンサーでは病初期に原因遺伝子を同定し、標的治療を早い段階から開始することを目指しているのでこれが解消されることが期待されている。

 イエール大学病院がんセンターの報告では現状の次世代シークエンサー頼りでは一筋縄に行かない症例があることが報告されている (Cecchini et al, Lancet, 2018) 。同じ変異 (ATM遺伝子) が検出された前立腺がんと未分化型肉腫の2つの症例に対して、変異を標的とした同じ化学療法 (Olaparib) を行った。ATM遺伝子とはBRCAという二本鎖DNAを修復するタンパク質であり、この変異が起きた癌細胞では相同組み換えに障害が生じる。通常であればPARPという一本鎖のDNAを修復する遺伝子の働きによって、この障害が修正されるのであるが、PARP阻害剤 (Olaparib) を投与することによって相同組み換えに障害がある腫瘍細胞のみに選択的に腫瘍細胞を崩壊させることができる(合成致死)。次世代シークエンシングを用いたイエール大学のPrecision Medicine Cancer Boardは、同じATM遺伝子の変異を持つ二人の患者に対してPARP阻害剤の投与を推奨した。同じ変異をターゲットにした標的療法を行ったにもかかわらず、前立腺がんの患者では寛解したのに対して、もう一方の未分化型肉腫の患者では増悪し死亡に至った。

 なぜ同じ変異のある症例に対して同じ標的療法を行ったにもかかわらず、全く異なった結果が表れたのだろうか。これにはいくつかの理由が考えられる。同じ遺伝子変異であっても違う腫瘍であること、変異の種類が違ったこと、同時に存在した他の変異が影響しうること、エピジェネティクスによって遺伝子発現が制御されたことなどである。このような多くの因子が患者に影響することが、次世代シークエンシングを用いる場合に念頭に置くべき課題である。

 セミナーでも触れられていた通り、次世代シークエンシングを用いた臨床試験はその結果からアンブレラ試験とバスケット試験という2つの試験に分類される。アンブレラ試験では違う部位の腫瘍であっても同じ変異の腫瘍であれば同じ分子標的治療薬によって寛解が期待できると示された試験である。対してバスケット試験では同じ遺伝子変異であっても違う臓器であれば薬剤への感受性が異なり、分子標的療法よりも従来の化学療法が勝るという試験である。最近、腫瘍の分子的特徴が、臓器や細胞の分化度といった「文脈」によって修飾されることが提唱されている (Schneider et al, Lancet, 2017)。さらに、癌化のシグナル伝達がある一定の閾値を超えて初めて細胞をがん細胞へと誘導することが知られているが、このシグナルの閾値も、組織型や分化度あるいは細胞がおかれた微小環境にも影響されうることが分かってきた。

次世代シークエンシングなどの技術の発展は確かに現在解決されていない多くの問題を明らかにしていくであろう。しかし新しい技術によってまた新たな難題が見えてくるということを医師・研究者は意識せねばならない。

国家試験まで使える医学生教科書

医学生の定期試験、普段の勉強、興味の勉強から国家試験対策まで使えると思った教科書を紹介する。私は、疾患や病態生理については文章で理解するのが好きなので、選書もそういった趣向になっている。

 

病態生理できった内科学(村川裕二先生著)の神経、血液、腎臓、内分泌はおすすめであり、この教科書を理解すれば予備校のビデオ講座など受ける必要は全くない。低学年の初学の段階から授業と並行してこの本を読み進めれば国家試験臨床研修まで確かな知識がつくと思う。答えが割れたことで話題になっていた必修C21の問題も、このシリーズの神経編の最初の章を読んでおけば即答できる問題であった。

 

STEPシリーズでは婦人科が論理的でずば抜けてよい。耳鼻科も病態生理が丁寧であり、授業から病院実習、国家試験まで使えた。眼科も悪くない。

 

病気がみえるは何冊かもっていたがイラストが凝っている割には文章で理解したい派の私としては大学2~4年生の初学者の段階ではあまり使いやすさを感じられなかった。ただ一度勉強してから見ると確かに分かりやすい。感染症、循環器はイメージをつかみやすく国家試験直前も愛用した。

 

循環器ではハーバード大学テキスト 心臓病の病態生理を図書館で借りて分からない疾患について読んでいた。病気がみえるよりも説明が丁寧で、買っても良いと思う。

 

標準シリーズでは標準精神科学が読んでいて楽しい。フォントに落ち着きがあり、読みやすい。

111回医師国家試験を受けた感想

医師国家試験について

 

①教材

私が国家試験の勉強に使った教材は、部活の先輩からいただいた2年前のQBとイヤーノート、学校の卒試、過去問3年分だけであった。模擬試験は1月のテコム模試だけを受けた。国試用に自分で買った教材はほぼ無いので、教材費を考えるとかなり安く済んだ。

個人的には自大学の教員をある程度信用しており、卒試の授業は8割以上真面目に聴いて気になるところは質問するようにしていた。予備校・ビデオ講座には一切手を出さなかった。使った教科書類は別の記事に書いたので参照してもらいたい。

国家試験の出題者は大学教員が担当することが多い現状、自大学の教員というリソースを存分に利用したほうがいいと思う。出題委員でなくても大学の先生は最近の医療のトピックを知っているので、授業は役に立つと思う。これは私の偏見であるが、大学の授業料を払っていながらビデオ講座だけで勉強するのは少しカッコ悪いと思う。

ただ、後から思えば「○○の値が上がるor下がるのはこの疾患!」みたいな横断的な知識やテクニックを身に着けるのであればビデオ講座の受講も悪くないと感じた。自大学の卒業試験の授業とクエスチョンバンクだけではその点は弱かった。

 

②勉強スケジュール、過去問

国家試験に合格した今となっては強気に書けるものの、私の勉強スケジュールは常に後手に回っており残念な感じであった。夏休みに入ってからようやくQBを解き始め、消化器・呼吸器・循環器のQBを2週した。秋からは卒試の科目に合わせてQBを半周~一周、12月初めにようやく全科目の1周が終わるという遅いスケジュールであった。12月の卒業試験の成績も100人中85番くらいだったようだ(呼び出しはぎりぎり受けなかった)。

このままだとまずいと思い年末年始は実家に帰らず、図書館にこもり本格的に勉強開始。1か月間毎日10時から22時まで図書館にいた。3年分の過去問と2年前のQB2~3週目を繰り返し、わからない箇所はイヤーノートや時には成書にあたるようにした。2年前のQBで勉強していたので3年分の過去問は初見の問題が多く、よい演習になった。大体7割~8割程度の正解率で安定しており、合格しそうだという自信がついてきた。間違えた問題も解説を読めば「なんだそういうことか」と思うことが多かった。正答率の高い問題を間違えるとショックであったが、友人の話を聞く限り多かれ少なかれ誰にでも正答率の高い問題を落とすミスはあるので、あまり気にしないことが大事だと思われる。

③国家試験当日

会場は東京の大正大学。試験期間中は新宿のホテルに友人と宿泊。初日は臨床で9割近く得点するものの、必修で大きなミスをし、「みんこれ」というサイトで69%という得点をたたき出してしまう。この「みんこれ」で出される数字にかなり落ち込んでしまった。後日、一部の解答速報が誤報であることが発覚し、実際は74%くらいであったのだが、3000人中2800位という順位を見て「これは落ちる」と本気で思ってしまい、とても胃が痛くなった。その日の夜はホテルでひとり関ジャニ∞の「ズッコケ男道」をyoutubeでずっと聞きながら自分を励ましていた。あとPuffyの「これが私の生きる道」も結構励まされる曲なのでおすすめです。

2日目は初日の必修の失敗が頭に残り、臨床問題で普段ではありえないようなミスを連発してしまった。解答を変えることで失敗みたいなことを各ブロックで3問以上やったと思う。2日目の必修と3日目の必修は初日とうってかわって簡単であり、ほぼ満点近く取れたので結果的に初日の失敗は帳消しになったが、2日目3日目の臨床問題での取りこぼしが今度は心配になり、試験が終わった直後は受かったとは到底思えなかった。試験が終わったあとはみんな晴れやかな顔をしていたが私は「これすれすれだろうな」というものであった。

④結果

結果としては一般79%臨床75%必修86%と多少余裕がある成績であった。ただ、大して見直しもしなかったので、合格発表までは心の中では「マークミスしていないか」などの不安は消えなかった。

⑤教訓

私の経験を、次年度受ける人に教訓として伝えるならば「国家試験期間中にはみんこれや解答速報などは見ないほうがいい」ということである。みんこれで解答を入力すると正答率95%の問題を外していたことに気づき、ショックを受けるかもしれない。国家試験の正攻法は皆が解ける問題を落とさないことだと言われているが、終わってみて思うのは90%以上の問題も結構落とせると思う(もちろん落としすぎはまずいが)。あと国試中も復習すべきみたいなことを言う人もいるが、気になったところだけ調べるだけで十分だと思う。休んだほうがいいです。

また、なるべく始めに考えた解答を変更しないことも重要である。見直しの際に選択肢を変更することで、かえって間違えてしまう問題が半分以上あった。もちろん見直しの際に読み過ごしていた記述に気づき、正解にたどり着くこともあるが、答えを変える場合はかなり慎重に判断したほうがよい。

⑥感想

臨床現場にせよ研究に進むにせよ、医師国家試験の努力はほぼ意味のないものに見えるが、役に立つ知識・考え方は少なくない。気がします。

友人と3日間ともに同じホテルで宿泊し励ましあったのは、今となっては良い思い出である。

ただ、もう二度と受けたくない試験であるのは間違いない。当日の試験教室の雰囲気、強面の試験監督、試験が終わった後に騒ぎ出す他大の学生、混雑した山手線…。

 

以上、まとまりのない文章だがこれで終わりにする。 

2018.2.12追記編集